生物学类论文范例 和磷灰石涂层用于调控神经细胞的生物学行为类论文写作资料范文

磷灰石涂层用于调控神经细胞的生物学行为，本文是生物学类参考文献格式范文和磷灰石和生物学和涂层方面论文写作资料范文.

摘 要: 利用仿生矿化法在钛合金表面制备磷灰石（Apatite）涂层,并通过仿生共沉积的方式在该涂层表面固定层粘连蛋白（Laminin,LN）,在钛合金表面构建磷灰石LN功能性复合涂层.通过场发射扫描电子显微镜（FESEM）和X射线光电子能谱仪（XPS）对磷灰石与磷灰石LN复合涂层进行表征,发现制备的磷灰石涂层呈现均一的多孔片层状结构,对LN分子有良好的固定能力.磷灰石LN复合涂层的LN释放实验结果表明：构建的磷灰石LN复合涂层中的LN分子可从涂层表面缓慢而持续地释放.神经细胞PC12与磷灰石、磷灰石LN复合涂层的联合体外培养实验结果表明：磷灰石、磷灰石LN复合涂层具有良好的生物相容性,且磷灰石LN复合涂层具有一定的促进神经细胞贴附和增殖的作用.制备的磷灰石涂层作为仿生共沉积生物活性分子的理想载体,在调控神经细胞生长以及周围神经损伤的修复领域有着良好的应用前景.

关键词： 磷灰石；层粘连蛋白；释放；PC12细胞

中图分类号： TS195.644

文献标志码： A

文章编号： 1673\|3851 (2018) 07\|0484\|07

0引言

周围神经损伤在现代生产生活中极为常见,具有较高的致残率,给病人、家庭和社会带来巨大的精神负担和经济损失［1］.如何促进受损神经的再生和恢复神经功能一直是生物医学界关注的热点.近年来,研究结果发现影响神经再生和修复的关键因素在于损伤神经所在的局部微环境［2］.因此,大量科学家致力于创造一些更能满足神经细胞生长需求的生理环境,以调控神经细胞的粘附、迁移、增殖和分化等生物学行为［3］.随着组织工程技术的高速发展,使用具有良好的生物相容性和生物可降解性的生物材料,并在其表面固定一系列生物活性分子,如细胞外基质蛋白中的层粘连蛋白（Laminin, LN）,逐渐成为调控神经细胞和促进神经修复的有效手段［45］.

目前研究中,在生物材料表面固定生物活性分子的常用方法主要为物理吸附法和化学共价接枝法［67］.Ong等［8］在医用钛表面吸附胶原骨形态发生蛋白,他们发现改性后的材料促细胞成骨分化的能力得到了显著的提高.Yang等［9］在高聚物基底首先制备聚多巴胺涂层,并通过聚多巴胺的活性基团共价固定精氨酰甘氨酰天冬氨酸蛋白质多肽,从而成功地促进了神经干细胞的增殖和分化.运用物理吸附法固定生物活性分子,不仅其吸附效率较低,而且固定的生物活性分子易从材料表面快速扩散,故该方法在实际运用中比较受到限制［10］.化学共价接枝生物活性分子,需要与有机化学溶液进行繁琐的交联,但可能会破坏基底材料的表面特征并使固定的生物活性分子变性［11］.因此,对于固定生物活性分子,开发一种简单而有效的固定化策略至关重要.

磷灰石是一种天然存在的无机材料,由于其具有优异的生物相容性和生物可降解性,同时对大量分子具有亲和力［1214］,因此被广泛用于生物医学领域.通过使用磷灰石涂层固定各种生物活性分子来调节细胞行为［1517］,将化学处理后的金属基底浸入含有CaCl2的Dulbeccos磷酸盐缓冲盐水中,生成多孔结构的磷灰石涂层［16］,该磷灰石涂层的优点在于生物活性分子可以通过与磷灰石同时共沉积来有效控制其用量［18］.此外,多种分子可以共沉积到磷灰石涂层中,并且可以从涂层表面进行缓慢而持续的释放,从而调控贴附的细胞行为.目前的研究表明,以磷灰石涂层作为载体,通过在其表面固定成骨生长肽和纤连蛋白,可促进间充质干细胞的粘附,增殖和成骨分化,并且固定雷帕霉素的磷灰石涂层具有抑制平滑肌细胞增殖的作用［16］.对于磷灰石涂层作为载体固定生物活性分子能否运用于调控神经细胞生长,国内外鲜有报道.

本文在医用钛合金基底仿生制备磷灰石涂层,通过仿生共沉积的方式在磷灰石涂层上固定层粘连蛋白LN,构建磷灰石LN功能性复合涂层；通过利用场发射扫描电子显微镜和X射线光电子能谱仪对磷灰石LN复合涂层进行表征,并对复合涂层中LN的固定量和释放情况进行研究；同时探究与复合涂层共培养的神经细胞PC12的生物学行为.

1材料与方法

1.1试剂与材料

钛合金（直径为10 mm,厚度为1 mm）、氯化钙溶液（100 mL,美国Sigma公司）、DPBS（不含钙、镁,美国Thermo Fisher公司）、层粘连蛋白Laminin（1 mg,美国Sigma公司）、MicroBCA试剂盒（美国Thermo Fisher公司）、CCK8试剂盒（上海碧云天公司）、livedead活死染液（美国Thermo Fisher公司）、鬼笔环肽FITC（上海碧云天公司）、鬼笔环肽罗丹明（美国Thermo Fisher公司）和PC12细胞（上海中科院细胞库）.所用试剂均为分析纯.

1.2主要仪器

ULTRA55型场发射扫描电子显微镜（德国ZEISS公司）、KAlpha型X射线光电子能谱仪（美国Thermo Scientific Corporation公司）、酶标仪（瑞士TECEN公司）、荧光倒置显微镜IX7122FL/PH（日本Nikon A公司）和激光共聚焦显微镜（日本Nikon A公司）.

1.3制备磷灰石LN复合涂层

用SiC砂纸（600目）仔细打磨钛片,之后依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗10 min,37 ℃下烘干备用.清洗后的钛片进行碱热预处理,具体步骤如下：将其放入水热反应釜中,并用30 mL 1 mol/L NaOH溶液浸泡,于140 ℃下反应6 h,碱热反应后得到的样品称为活化钛片,用去离子水对活化钛片进行三次超声清洗,每次持续3 min,37 ℃下烘干备用.

量取450 μL CaCl2母液,加入至500 mL Dulbeccos磷酸盐缓冲盐水（DPBS）溶液中,振荡至完全溶解,使Ca2+浓度为100 mg/L,配制成本实验中用于磷灰石涂层制备的仿生矿化液,简称为mDPBS（Modified DPBS）溶液.再量取400 μL LN母液,溶解于10 mL mDPBS溶液,配制得到浓度为40 μg/mL的LN溶液,简称为mDPBSLN40.对mDPBSLN40溶液进行浓度梯度稀释,分别得到20、10 μg/mL和5 μg/mL的LN溶液,简称为mDPBSLN20、mDPBSLN10和mDPBSLN5,用于制备磷灰石LN涂层.

将活化钛片浸泡在mDPBS溶液中,37 ℃下反应24 h；反应结束后,用去离子水清洗样品表面,室温下干燥,得到钛表面的磷灰石涂层,样品标记为Apatite.将样品Apatite分别浸泡于1 mL mDPBSLN5、mDPBSLN10、mDPBSLN20和mDPBSLN40溶液中,25 ℃下反应24 h,获得磷灰石LN涂层,分别标记为ApatiteLN5、ApatiteLN10、ApatiteLN20和ApatiteLN40.

1.4材料表征

用场发射扫描电子显微镜（FESEM）表征钛表面Apatite涂层的表面形貌设定扫描电压为15.0 kV.用X射线光电子能谱仪（XPS）对Apatite涂层与ApatiteLN复合涂层进行表征,检测两者的元素含量的差异,设定测试条件为：扫描型Ar+,溅射速率约为94 nm/min,发射电流为20 mA,能量为4.0 kV.

1.5磷灰石LN复合涂层的LN固定量的检测

将具有Apatite涂层的钛片在DPBSLN溶液浸泡24 h后,收集残余溶液.浸泡前DPBSLN溶液为对照组,浸泡后残余溶液为实验组ApatiteLN5、ApatiteLN10、ApatiteLN20和ApatiteLN40复合涂层组,用MicroBCA试剂盒检测对照组和实验组的LN浓度,计算出浸泡前LN的不同浓度下,Apatite涂层对LN的固定含量.

1.6磷灰石LN复合涂层的LN的体外释放实验

选取ApatiteLN20复合涂层,将其浸泡在PBS溶液中,分别于浸泡后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d和28 d时收集残余溶液,通过MicroBCA试剂盒检测溶液中LN的浓度,计算出ApatiteLN复合涂层的LN的释放量与LN固定含量的百分比.

1.7细胞实验

1.7.1磷灰石涂层与磷灰石LN复合涂层的细胞相容性研究

用CCK8试剂盒测定Apatite涂层与ApatiteLN复合涂层的生物相容性.其方法是将含有涂层的钛片灭菌后置于48孔板,用DMEM高糖培养基浸泡72 h,制备出Apatite涂层与ApatiteLN20复合涂层的浸提液.将PC12细胞以5×104个/mL的细胞密度接种于96孔板,12 h后吸取培养基,分别添加Apatite涂层与ApatiteLN复合涂层的浸提液、新鲜的DMEM高糖培养基和0.64%的苯酚.Apatite涂层与ApatiteLN20复合涂层的浸提液为实验组,新鲜培养基和0.64%的苯酚组分别为阴性和阳性对照组.换液培养24 h和48 h后,进行CCK8实验,在波长450 nm处用酶标仪测取OD值,记录结果,并计算平均值.

将PC12细胞以5×104个/mL的细胞密度接种于48孔板,12 h后吸取培养基,分别添加Apatite涂层与ApatiteLN复合涂层的浸提液、新鲜的DMEM高糖培养基和0.64%的苯酚.换液培养24 h和48 h后,进行livedead细胞染色法对细胞进行染色并观察.

1.7.2磷灰石涂层与磷灰石LN复合涂层对细胞贴附性能的研究

将含有Apatite涂层与ApatiteLN5、ApatiteLN10、ApatiteLN20和ApatiteLN40复合涂层的钛片灭菌后置于48孔板,之后将PC12细胞以4×105个/mL的细胞密度接种于涂层表面,种植于48孔板表面的细胞作为对照组,在无血清的DMEM高糖培养基中孵育4 h.采用CCK8试剂盒定量检测PC12细胞在涂层表面的贴附情况,利用SPSS软件进行统计学分析.并进行鬼笔环肽FITC/DAPI双染来观察PC12细胞在涂层表面贴附的形貌.

1.7.3磷灰石涂层与磷灰石LN复合涂层对细胞增殖性能的研究

将含有Apatite涂层与ApatiteLN复合涂层的钛片灭菌后置于48孔板,之后将PC12细胞以2×104个/mL的细胞密度接种于涂层表面,种植于48孔板表面的细胞作为对照组,在DMEM高糖培养基中分别培养1、3 d和5 d.采用CCK8试剂盒定量检测PC12细胞在涂层表面增殖1、3 d和5 d的情况,利用SPSS软件进行统计学分析；通过鬼笔环肽罗丹明/DAPI双染来观察PC12细胞在涂层表面增殖5 d的形貌.

2结果与讨论

2.1磷灰石涂层的形貌分析

碱热预处理后的钛片浸泡于DPBS溶液中24 h后,实验过程中肉眼可观察到其表面形成一层肉眼可见的白色涂层.图1为涂层的FESEM图,结果显示,该涂层由一种多孔均一的片层状结构晶体组成,与先前研究中观察到的结果相一致［15］.Apatite涂层这种彼此相连的微孔结构,使其具有一定的固定生物活性分子的能力,从而能够构建ApatiteLN复合功能性涂层.

图1钛表面Apatite涂层的FESEM图

2.2磷灰石涂层与磷灰石LN复合涂层的N元素含量分析

表1为通过XPS所检测的Apatite涂层与ApatiteLN5、ApatiteLN10、ApatiteLN20、ApatiteLN40复合涂层的各种元素含量的比较,由表可见,Apatite涂层中由于不含有LN而无法检测到N元素,而ApatiteLN复合涂层的N元素含量显著提高,并且随着LN浓度的提高,ApatiteLN复合涂层中所能检测到的N元素含量也逐渐提高,表明LN被成功地共沉积到Apatite涂层上.

2.3磷灰石LN复合涂层的LN固定量的分析

通过MicroBCA试剂盒,对于实验组ApatiteLN5、ApatiteLN10、ApatiteLN20和ApatiteLN40复合涂层组和对照组LN浓度的检测与计算,结果如表2所示；在LN原始浓度分别为5、10、20 μg/mL和40 μg/mL时,磷灰石涂层所能固定的LN含量分别为1.43、3.96、4.14 μg和5.88 μg.本实验结果证明Apatite涂层这种多孔的微晶结构对于LN分子具有比较良好的固定性能.

表2Apatite涂层中LN含量的分析

涂层ApatiteLN5ApatiteLN10ApatiteLN20ApatiteLN40

层粘连蛋白LN的固定量/μg1.43&plun;0.553.96&plun;0.884.14&plun;0.755.88&plun;1.23

2.4磷灰石LN复合涂层的LN的体外释放的分析

将ApatiteLN20复合涂层,将其浸泡在PBS溶液中6 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d和28 d后,对涂层中LN在PBS溶液中的释放量进行计算对比,结果如图2所示.图2表明,LN分子在14 d内进行相对快速地释放,14 d的释放量达到19.75%,随后LN分子基本保持了相对较为缓慢的释放率,直到释放实验至28 d,其释放量达到20.72%,这表明固定的LN分子是从涂层表面缓慢而持续地释放出来,达到较好的缓释效果.通过物理吸附方式在材料表面固定的蛋白分子在短时间内会进行暴释,而仿生共沉积的LN分子1 d和3 d的释放量较低,分别为3.47%和3.82%；同时有研究表明,仿生共沉积的荧光标记蛋白在磷灰石涂层内部可被直接观察,且共沉积蛋白后的涂层为碳化的磷灰石涂层［19］,因此固定于涂层中的LN分子可能不是简单的吸附在其表面,而是参与到涂层的晶格构建中.

图2ApatiteLN复合涂层中LN的释放量

2.5磷灰石涂层与磷灰石LN复合涂层对神经细胞PC12的生物学行为的研究分析

2.5.1磷灰石涂层与磷灰石LN复合涂层的细胞相容性研究分析

图3为CCK8检测结果,结果表明：与阴性对照组相比,实验24 h后,Apatite和ApatiteLN组的PC12细胞活力分别为119.73%和148.96%；实验48 h后,其细胞活力稍稍降低,分别为108.91%和114.35%.这明显高于根据ISO标准（ISO 10993-5－2009）所设定的70%的细胞毒性阈值［20］.这表明,与阴性对照相比,Apatite涂层和ApatiteLN复合涂层浸提液,有利于细胞生长.而与Apatite组相比,ApatiteLN组的细胞活力相对有所提高,其原因可能由于在制备ApatiteLN复合涂层浸提液的过程中,LN从中释放出来,在一定程度上,促进神经细胞PC12的生长.

图3Apatite涂层与ApatiteLN复合涂层浸提

液对PC12细胞生长影响的分析

图4为PC12细胞dead/live染,从图中可以看出,阴性对照、Apatite涂层和ApatiteLN复合涂层活细胞数目较多,与CCK8检测结果相一致,表明Apatite涂层与ApatiteLN复合涂层的细胞相容性比较优异.

2.5.2磷灰石涂层与磷灰石LN复合涂层对细胞贴附性能的分析

PC12细胞在无血清的DMEM高糖培养基中培养4 h后,对Apatite涂层与ApatiteLN复合涂层上贴附的细胞进行定量分析,结果如图5所示.

图4Apatite涂层与ApatiteLN复合涂层的浸提液培养后的PC12细胞dead/live染色

从图5中可以看出,Apatite涂层表面贴附的PC12细胞数量明显低于对照组,而固定LN分子后的ApatiteLN复合涂层表面贴附的PC12数量则明显增大.其中,ApatiteLN5组材料的促细胞贴附能力接近于对照组,而ApatiteLN10、ApatiteLN20和ApatiteLN40组材料的促细胞贴附能力均优于对照组,且随着Apatite涂层结合的LN的增加,涂层表面促PC12细胞贴附能力逐渐增强.这说明,Apatite涂层能够作为固定LN分子的有效载体,具有应用于神经细胞生长的潜在价值.本文通过鬼笔环肽FITC/DAPI双染法来观察PC12细胞在Apatite涂层与ApatiteLN复合涂层的贴附形貌,结果如图6所示.图6中可见贴附在Apatite涂层的细胞最少,当Apatite涂层固定有LN分子时,更多的细胞贴附在样品表面,且随着LN浓度的增加,细胞贴附数目逐渐增多,与图3所述的细胞贴附的定量检测结果一致.并且,ApatiteLN40组贴附的细胞在样品表面铺展良好,可以明显观察到细胞呈梭形且伸出伪足,这能进一步提升细胞的贴附性能.细胞的早期贴附对于随后的增殖是极其重要的,LN作为一种细胞粘附蛋白,可以促进细胞的贴附,并且对于细胞的贴附形貌和细胞的功能至关重要.

图5PC12细胞贴附于Apatite涂层与ApatiteLN

复合涂层的定量分析

注：**表示p<0.01,分别对Apatite组和其他组进行统计学分析.

图6PC12细胞贴附于Apatite涂层与ApatiteLN复合涂层的鬼笔环肽FITC/DAPI染色

2.5.3磷灰石涂层与磷灰石LN复合涂层对细胞增殖性能的研究分析

经过5 d的PC12细胞与Apatite涂层与ApatiteLN复合涂层的共培养和CCK8实验的检测,结果如图7所示.细胞在Apatite涂层、ApatiteLN复合涂层上展现出较好的增殖.细胞增殖1 d后,对照组细胞的增殖水平明显高于Apatite和ApatiteLN组（p＜0.05）.ApatiteLN复合涂层上种植的细胞在1 d后开始进入增殖速率较快速的增殖期,并且在第3 d后,种植于ApatiteLN复合涂层表面的细胞增殖情况与对照组已无明显差异（p＞0.05）.第5 d时,ApatiteLN复合涂层上的细胞增殖数目与对照组几乎持平（p＞0.05）.Apatite涂层上的细胞处于不断增殖状态,然而,在增殖1、3 d和5 d时,细胞增殖水平仍然明显低于对照组和ApatiteLN组（p＜0.05）.这说明,Apatite涂层能够维持神经细胞PC12的生长增殖,而固定有细胞粘附蛋白的ApatiteLN复合涂层由于其表面的LN分子的缓慢持续释放,从而表现出对于神经细胞PC12的良好促增殖能力.

细胞生长至第5 d的鬼笔环肽罗丹明/DAPI染色结果如图8所示,结果显示：在ApatiteLN复合涂层上的细胞数目明显较纯Apatite涂层多,与CCK8实验的检测结果相一致；种植于ApatiteLN复合涂层的细胞铺展良好,较多的PC12细胞长有突起和树枝状的细胞连接,呈现出神经元样的外观形貌；而种植于纯Apatite涂层上的细胞未明显见到神经突的形成.以上结果证实：ApatiteLN复合涂层持续释放的LN分子能够形成促进神经突生长的环境,固定有细胞粘附蛋白的ApatiteLN复合涂层是适合神经细胞贴附和生长的材料,具有一定的神经相容性.

3结论

本文运用仿生共沉积法在Apatite涂层表面固定LN分子,构建ApatiteLN功能性复合涂层.首先对涂层的微观形貌和化学组成进行了检测和分析；其次,对涂层的蛋白固定性能和缓释性能进行了研究；最后探究与涂层共培养的神经细胞PC12的生物学行为,主要研究结论如下：

a) FESEM结果表明,通过仿生矿化法可以制备出多孔均一的Apatite涂层,并且XPS N元素检测结果显示,运用仿生共沉积法可以在其表面固定LN分子,形成ApatiteLN复合涂层.

b) 通过蛋白定量检测可知,当蛋白原始浓度分别为5、10、20 μg/mL和40 μg/mL时,ApatiteLN复合涂层中的蛋白含量约为1.31、3.90、4.20 μg和4.55 μg.实验结果表明,本文采用的仿生矿化共沉积法能够在Apatite涂层上迅速有效地共沉积LN分子.

c) ApatiteLN复合涂层中LN分子体外释放结果表明,LN保持相对较为缓慢的释放率,在体外可以进行持续可控的释放,直到释放实验至28 d,其释放量约为20.72%.

d) 通过神经细胞PC12的体外培养研究表明,ApatiteLN涂层的生物相容性比较优异,且仿生共沉积的LN分子能够显著地提高PC12细胞的贴附和铺展能力,并能够有效地促进细胞的增殖和突触形成.

本文制备的Apatite/LN涂层对蛋白分子具有良好的固定能力；对于所固定的蛋白分子达到比较优异的缓释效果；在对神经细胞PC12的培养、贴附和增殖方面起到一定的促进作用,显示Apatite涂层可作为生物分子的有效载体,在调控神经细胞生长以及周围神经损伤的修复领域有着良好的应用前景.

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括而言之：上文是适合不知如何写磷灰石和生物学和涂层方面的生物学专业大学硕士和本科毕业论文以及关于生物学论文开题报告范文和相关职称论文写作参考文献资料.

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