论文qPCR常见问题与分析解决办法，该文是常见问题类有关在职开题报告范文与qPCR常见问题和分析解决办法和常见问题方面函授毕业论文范文.
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qPCR 即实时荧光定量核酸扩增检测系统,也叫实时定量基因扩增荧光检测系统.昆山吉和力仪器有限公司整理了一些关于qPCR 的常见问题,并对这些问题一一进行了解答.
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qPCR 的英文全称是Real-timeQuantitative PCR Detecting System,即实时荧光定量核酸扩增检测系统,也叫实时定量基因扩增荧光检测系统,简称qPCR.
简单来说,qPCR 就是利用荧光信号的变化,实时监测PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析.而常规的PCR 无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时监测.
如何提高RT-PCR 反应的灵敏度与特异性？
①确定模板RNA 完整性,无DNA污染；
② RNA 模板中不应含有扩增反应抑制剂；
③为了防止模板降解,在反应体系中加入RNase 抑制剂RNasin；
④使用适量的模板RNA,模板量太多会降低特异性,太少会导致扩增不出条带或条带太弱；
⑤若模板中有二级结构,可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果；
⑥设计引物时,避免在引物3’端含有互补序列,避免形成内部发卡结构.
避免RNA 降解的方法有哪些？
①在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA；
②运用良好无污染技术分离RNA；
③将组织从动物体取出后立刻提取RNA,并将提取好的RNA 反转录为cDNA 进行低温保存.
RNA中含有逆转录抑制剂时,怎么处理？
逆转录抑制剂包括：SDS、EDTA、甘油、焦磷酸钠、亚精胺和胍盐,可将对照RNA 与样品混合,同对照RNA反应比较产量以检测RNA 抑制剂；若对照RNA 与样品混合后产量降低,则说明样品中存在逆转录抑制剂,可用70%（v/v）乙醇对RNA 沉淀进行清洗,以除去抑制剂.
如何减少RNA 模板中的二级结构？
①将RNA 和引物在不含盐及缓冲液条件下变性、退火,提高逆转录反应温度；
② 温度超过60 ℃ 时, 不能使用oligo（dT）引物,选择一个在反应温度可以退火的GSP；
③ RT-PCR 产物的长度超过1kb时,反应温度需保持在65℃.
RNA 中有DNA 污染的处理方式①若是基因组DNA 的污染,可使用DNaseI 处理RNA,同时设置没有逆转录对照组反应检测DNA 污染；
②若是受到外源DNA 的污染,可使用抗气雾剂和UDG 酶.
qPCR 探针设计的一般原则有哪些？
①扩增片段的长度不应太大,一般小于300bp；
②探针不能和任一引物互补,且其长度在保证特异性的前提下尽可能的短,长度不要超过30bp；
②探针的Tm 值至少比引物的Tm值高5 度；
③探针如用于检测多态位点,多态位点应尽可能靠近探针中部；
④探针5’端不能是碱基G,G 对荧光基团有猝灭作用.
无反转录酶情况下,对照RNA 仍有扩增结果
①体外转录时不可能将所有DNA模板消除,因而对照组会含有痕量的DNA.建议可将第一链cDNA 稀释1:10、1:100、1:1000 倍以消除DNA 污染造成的影响；
②可能是引物二聚体的条带.
扩增产物滞留在加样孔中
①可能是由于模板量过高而导致PCR 结果产生了高分子量的DNA 胶状物,建议将第一链cDNA 浓度稀释至100 倍再进行二次扩增；
②在二次PCR 时,使用的退火温度如果比引物的Tm 值低5℃,可将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性.
无Ct 信号出现
①反应循环参数不够,一般要在35 个循环以上,但是过多的循环次数可增加背景值；
② 检测荧光信号的步骤有误.SYBRgreen 法（SG 法）采用的是72℃延伸时采集荧光信号,taqman 法则是在退火结束或延伸结束时进行信号采集；
③引物或探针降解,可用PAGE 电泳检测其完整性,若是电泳条带呈弥散状,可考虑重新合成引物或探针；
④模板不足或降解,则可以重新提取核酸模板.
Ct 值出现过晚（Ct>38）①扩增效率低,反应条件不够优化,降低退火温度,增加镁离子浓度；
②反应成分降解或加样量不足；
③ PCR 产物过长,一般采用80-150bp.
标准曲线线性关系不佳
①加样存在误差,是样品浓度不成梯度；
②标准品出现降解, 避免反复冻融；
③引物或者探针设计不佳；
④模板中存在抑制物或模板浓度过高.
溶解曲线存在多个主峰
①引物设计不够优化；
②引物浓度不佳,上下游引物浓度比例不一致；
③镁离子浓度过高；
④模板基因组的污染.
同一样品中,其中某一个荧光信号特别强
①试剂配制时反应液没有完全溶化,导致探针量在一管增多；
②试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同；
③ PCR 仪热槽被荧光物质污染,需要清除热槽中的污染.
扩增曲线有一向上或向下的尖峰？
①反应过程中电压不稳定；
②可能在20 个循环左右时,仪器有停下或仪器有开盖,使光线突然增强；
③如果尖峰向下,可能是由卤素灯老化所致,这时应更换.
部分样本扩增效率过低？
①提取液残留,一定程度抑制了PCR 反应；
②反应液未严格取量混匀或分装不均匀；
③试剂失效.
阴性对照或空白对照翘尾
①模板提取环境或操作过程有污染；
②配液过程存在污染.
直线型扩增曲线
①探针部分降解：一般稀释的探针可在4℃保存至少3 个月,探针的反复冻融或导致降解；或者探针在光线下暴露时间太长了；
②反应液中有PCR 抑制物.
没有扩增曲线
① PCR 参数设置错误,在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步,即stage1 阶段；
②电脑设定了自动休眠.
基线下滑
基线选取范围不对,可试着将基线范围改大一些,这一问题常因试剂质量所致.
扩增曲线断裂
基线选取范围不对,基线终点大于Ct 值,这通常是由于模板DNA 浓度过高所致,因Ct 值<15,而基线范围仍取3~15,其中包含部分扩增信号,导致标准差偏大,阈值过高,解决办法：减少基线终点至Ct 前4 个循环,重新分析数据.
样品浓度跨度过大
样品浓度过高,导致阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线,其解决方法同“扩增曲线断裂”.
山坡形曲线
常因反应管封口不严,至反应液蒸发所致.
综上而言，此文是一篇关于常见问题方面的大学硕士和本科毕业论文以及qPCR常见问题和分析解决办法和常见问题相关常见问题论文开题报告范文和职称论文写作参考文献资料.
参考文献：
1、 成都市社会工作督导存在问题与其解决办法 作者简介李学林,男,西南石油大学马克思主义学院教授、副院长 研究方向马克思主义哲学及社会学 张睿（导师李学林教授）,男,西南石油大学法学院在读研究生,硕士学历 研究方向社会工作 邮箱412440672.
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