论文花粉管通道法转Bar基因胡麻后代的分子检测，本文是关于检测类在职毕业论文范文跟花粉管和胡麻和基因类参考文献格式范文.
苏文杰
（ 通渭县鸡川镇政府,甘肃 定西 743300 ）
摘 要：以花粉管通道法转Bar基因胡麻T1代胡麻为研究对象,用CTAB法提取DNA,经PCR分别扩增外源基因Bar基因的片段,扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测分析,筛选Bar基因成功整合到基因组的单株,结果在114个T1系亚麻植株中检测出5株含有Bar基因的阳性亚麻植株,转化率为4.4%.探讨了花粉管通道法转Bar基因在亚麻中的应用前景.
关键词：花粉管通道法；转基因；胡麻；PCR检测
文章编号： 1005-2690（2017）03-0117-02中图分类号： S512.1文献标志码： B
1 前言
油用亚麻,又名胡麻,拉丁学名Linum usitatissimum,属于亚麻科亚麻属普通亚麻的一个变种,是一年生或多年生草本植物.油用亚麻是我国五大油料作物之一,主要分布在甘肃、内蒙古、山西、宁夏、河北、新疆及青海等省区.
利用转基因技术育种可以打破物种间的遗传障碍,实现优良目的基因的定向转移,同时具有后代易于稳定、育种周期短等优点,为作物育种和品质改良提供了新的途径.已报道亚麻遗传转化主要采用基因导入法和农杆菌侵染法,但这两种方法都需要经历组织培养的过程,具有实验设备配备要求高、操作复杂、周期长、成本高等缺点.花粉管通道法是利用植物授粉后形成的天然花粉通道,经珠心通道,将外源DNA携入胚囊,从而转化早期胚胎细胞的方法.它避免了繁琐的组织培养过程,操作简单、成本低廉,可直接用于常规育种.自花粉管通道法问世以来,已在水稻等多种植物的遗传转化中取得成功,但应用在油用亚麻的遗传转化尚未见报道[1].
Bar基因能使植物抵抗如草丁膦等以PPT为活性成分的除草剂,具有PPT活性的除草剂具有输导型灭生性,杀草谱广,对植物的地上部分和地下部分均有枯杀作用,而且在土壤中易被代谢分解,残留期短,半衰期只有2~3 d.目前,Bar基因已导入水稻、玉米、小麦、大麦、烟草、马铃薯、番茄、高粱、燕麦、甘蔗、番术瓜、菜豆、豌豆、棉花等作物[2].本论文以花粉管通道法导入Bar基因的T1代胡麻材料为研究对象,通过PCR分子检测手段筛选Bar基因成功整合到基因组的单株,并统计分析转化效率,为开展胡麻转基因育种后续研究奠定基础.
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 植物材料
试验用花粉管通道法转Bar基因胡麻T0代由甘肃省农业科学院作物研究所胡麻课题组提供,播种后分单株取样检测.
2.1.2 主要试剂
Premix Taq DNA 聚合酶、dNTP、DNA Marker均购自宝生物工程（大连）有限公司,PCR引物由Invitrogen公司合成.
2.1.3 主要仪器
台式冷冻离心机、基因扩增仪、凝胶成像仪、电泳仪及移液.
2.1.4 主要缓冲液配方
CTAB提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl (pH值8.0),20 mmol/L EDTA (pH值8.0),1.5 mol/L NaCl, 2% CTAB (W/V),4% PVP40 (W/V)和2% 巯基乙醇 (V/V),PVP和巯基乙醇使用前加入[3].TE：10 mmol/L Tris-HCl （pH值8.0）,1 mmol/L EDTA.6琼脂糖凝胶电泳上样缓冲液：0.25%溴酚蓝 (W/V),40%蔗糖 (W/V).1TAE电泳缓冲液：40 mmol/L Tris-乙酸,1 mmol/L EDTA.
2.2 方法
2.2.1 CTAB法提取DNA
取样：摘取T1代114株胡麻的幼嫩组织,然后分管冷藏.
2.2.2 PCR扩增
以含有由CaMV35S 启动子、Bar基因和NOS 终止子组成的表达框的质粒pG4A作为PCR 检测的阳性对照,未进行转基因操作的胡麻植株为阴性对照,水做空白对照,用Bar基因引物进行PCR扩增.
反应体系如下：
Premix Taq Mix 6.25 μL
Bar-F 1.0 μL
Bar-R 1.0 μL
DNA 1.0 μL
ddH2O 3.25 μL
总体积 12.5 μL
PCR循环参数：94℃预变性 3 min,94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸30 s,72℃后延伸5 min,经32个循环后10℃保存.
2.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测
1.5%琼脂糖电泳点样总量为6 μL体系,加样顺序为1 μL溴酚兰+5 μL扩增样品.
3 结果与分析
3.1 结果
3.1.1 PCR 阳性植株的鉴定
为了验证Bar 基因的导入与否,将T1代114株胡麻的幼嫩组织摘取分管冷藏,以阳性植株为对照进行PCR分析.从中提取DNA 进行Bar 基因的扩增,其结果如图1所示.
3.1.2 花粉管通道法转化率分析
如表1所示,在提取的114株亚麻中检测到含有Bar基因的阳性植株有5株,转化率为4.4%.
4 讨论
本试验用花粉管通道法将Bar 基因导入胡麻,在114 个T1代植株植株中检测出5个转基因植株,转化效率为4.4%.可以说明转基因植株T0～T1遗传抗性并不稳定,遗传转化效率低,这可能是由于外源Bar 基因插入早期没有在受体染色体中稳定,从而呈现不规律分离.为验证花粉管通道法转Bar基因亚麻植株的稳定性,应在T2及其以后的世代中继续遗传抗性的检测,直到以后的世代中出现稳定遗传的株系,并进行相关分子生物学实验判断Bar 基因在受体中的拷贝数和插入位点,才能进一步探讨花粉管通道法转Bar基因在亚麻中的应用前景.
参考文献：
[ 1 ] 党占海,张建平.温敏型雄性不育亚麻的研究[J].作物学报,2002,28(6):861-864.
[ 2 ] Hess D.Investigation on the Intra-and Interspecific Traner of Anthocyanin Genes using Pollen as Veetors.
Z.Pflanzenphysiol.Bd.9 8s,1980:321-327.
[ 3 ] 黄骏麒,钱思颖,刘佳玲,等.外源海岛棉DNA 导致陆地棉性状变异[J].遗传学报,1981,8 (1):56-62.
（收稿日期：2017-02-10）
括而言之，该文是一篇关于对写作花粉管和胡麻和基因论文范文与课题研究的大学硕士、检测本科毕业论文检测论文开题报告范文和相关文献综述及职称论文参考文献资料有帮助.
参考文献：
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