论文活细胞成像技术在生殖医学中的应用，本文是关于成像技术方面本科毕业论文范文和生殖医学和细胞成像技术和研究有关毕业论文提纲范文.
（[1]安徽医科大学生殖健康与遗传安徽省重点实验室安徽·合肥230032；
[2]安徽医科大学第一附属医院妇产科生殖中心安徽·合肥230022）
中图分类号：G642 文献标识码：A DOI：10.16871/j.cnki.kjwhc.2018.04.036
摘 要生殖医学是一门临床综合性学科,涉及临床医学、基础医学、细胞生物学、分子生物学、遗传学等多个学科.随着社会的迅速发展、生育年龄推迟和国家“二孩政策”的全面放开,各种疾病导致的生育功能低下和生育质量下降目前已成为生殖领域的突出问题,但是大部分不孕不育相关疾病病因不明.生殖医学研究人才的匮乏,严重限制了生殖医学研究的进展.活细胞成像技术可以模拟活细胞的生存环境,维持活细胞长时间的生长繁殖和追踪观察,在生殖医学研究中所占比例越来越重,对研究不孕不育相关疾病的病因提供了强有力的支持.现根据近年来对研究生和本科生进行的生殖医学基础实验带教工作,本文主要总结分析活细胞成像技术在生殖医学研究中的应用.
关键词生殖医学活细胞成像细胞培养实验教学
On the Application of Live Cell Imaging Technology inResearch of Reproductive Medicine // Liu YajingAbstract Reproductive medicine is a clinical comprehensivesubject, involved in clinical medicine, basic medical sciences,cell biology, molecular biology, genetics, and many other subjects.With the rapid development of society, the delay of childbearingage and the release of "comprehensive two-child policy",low reproductive function and the decline in the quality causedby all kinds of disease has become a prominent question in thereproductive field, but the etiology of most infertility related diseaseswas unknown. The scarcity of reproductive medical researchtalents seriously limits the research progress of reproductivemedicine. Live cell imaging techniques can be used to simulatethe environment of living cells, and maintain the growth andreproduction of living cells for a long time and observe them,which is increasing in the proportion of research in reproductivemedicine, and provides a strong support to study the pathogeny ofsterility related diseases. Based on the recent research on the basicexperimental teaching of reproductive medicine for graduatestudents and undergraduates, this paper mainly summarizes theapplication of live cell imaging technology in the research of reproductivemedicine.
Key words reproductive medicine;live cell imaging;cell culture;experiment teaching
我国是人口大国,育龄妇女的不孕不育率高达10%—15%,人工流产数占全球年人工流产数的近50%,多种妊娠并发症和复发性、不明原因性流产严重危害30-40%育龄女性及其后代的健康.不孕不育已经成为仅次于肿瘤和心血管疾病的第三大疾病,给社会和家庭带来了巨大的负担.随着社会的迅速发展、生育年龄推迟和国家“二孩政策”的全面放开,各种疾病导致的生育功能低下和生育质量下降目前已成为生殖领域的突出问题,但是大部分不孕不育相关疾病病因不明.阐明不孕不育相关疾病的分子机制并依此提出切实可行的防治对策是生殖医学领域亟待研究的课题,也是我国经济与社会发展的重大需求.为了培养高水平的生殖医学专业研究人才,近年来各医学类院校在本科生和研究生教学中都开设了生殖医学基础与临床课程.
活细胞成像技术是生殖医学研究中一项必不可少的技术.活细胞成像技术可以模拟活细胞的生存环境,维持活细胞长时间的生长繁殖和追踪观察,在生殖医学研究中所占比例越来越重,对研究不孕不育相关疾病的病因提供了强有力的支持.本文主要根据近年来对研究生和本科生进行的生殖医学基础实验带教工作,总结分析活细胞成像技术在生殖医学研究中的应用.
1 活细胞成像实验前准备在生殖医学基础实验中的重要性
活细胞成像技术主要是在活细胞状态下通过采集显微镜下的图像来研究活细胞的方法.一套完整的活细胞成像系统包括全电动倒置荧光显微镜、合适的光源、高速电动荧光光闸、电动载物台、电动聚光镜（实现明场和荧光的切换）、电动激发光/ 发射光的滤转轮、高速高灵敏冷CCD、活细胞培养系统、控制软件等.
活细胞成像技术不仅能够在亚细胞水平观察线粒体、内质网等在细胞的动态变化,也能够在分子水平研究细胞的功能,已经成为细胞生物学、发育生物学及医学研究中一项必不可少的技术.它对于活细胞实时、动态变化的观察使得研究人员对细胞运作的整个过程认识得更加深入,并且保证了实验结果的真实可靠.但活细胞成像技术面临的一个最主要的挑战是如何在整个实验过程中保持细胞的活性,并使细胞的机能尽可能接近于自然状态.整个实验过程中的光照特别是荧光光照对细胞具有光毒性.尤其是生殖医学相关的实验中,卵子本身对外界的各种刺激比较敏感,要想使实验取得成功,必须对实验的整个过程包括实验前的准备等进行精心的设计,最大程度地保证卵细胞在整个实验过程中一直处于最佳的生理状态.活细胞成像技术的实验前准备非常重要,因为活细胞成像的前提是细胞培养和细胞转染的成功.尽量让学生参与实验前的准备工作,包括培养皿的准备、细胞培养的准备、质粒的准备以及细胞转染的准备等.
2 活细胞成像实验的准备过程及注意事项活细胞成像时为了保证获得较好的分辨率,接种卵细胞或者卵巢颗粒细胞时尽量使用0.17-0.19 毫米厚的玻璃底培养皿.因为塑料培养皿在短波长激发时会发出自发荧光,降低了荧光检测的信噪比.对于不容易在玻璃上生长的细胞,使用预先包被了多聚赖氨酸的玻璃底培养皿.
细胞培养的成败是活细胞成像的关键.细胞培养过程中首先一定要避免细菌、支原体或真菌的污染.另外,不同的细胞需要不同的培养基,血清和添加物.
如果实验过程中需要细胞转染,为了提高细胞转染效率,用于细胞转染的质粒DNA 必须无蛋白质、RNA 和其它化学物质的污染.一般要保证OD260/280 比值在1.8 左右.如果OD260/280 比值大于1.9,质粒中可能有RNA 的污染.如果OD260/280比值小于1.6,则质粒中可能有蛋白质、酚等污染.为了获得较高的转染效率,细胞接种时需要一定的细胞密度.细胞转染时贴壁细胞的密度以70-90%为最好.一般要求在转染前24 小时将细胞传代,这样可增加细胞对外源DNA 摄入的可能.并且,最好在转染前4 小时换一次新鲜的细胞培养液,以保证细胞在转染前处于比较好的状态.另外,转染的过程中最好同时设有阳性对照和阴性对照.
预实验对于整个活细胞成像实验的成功是非常重要的.在实验过程中需要同时设立阳性对照和阴性对照组,以首选确保在成像过程中细胞的功能没有受到不利影响.
在整个实验过程中,需要使卵细胞处于最佳的生理状态,避免温度,湿度,渗透压,pH 值等各指标发生波动,最大程度地减少因各种原因造成的图像模糊.进行活细胞成像时要保证细胞培养过程的稳定性,要避免过强的激发光对细胞造成的损伤和对荧光的漂白等.在保证满足活细胞成像观察的前提下,尽量增加拍摄的时间间隔,缩短时间,减少光照对卵细胞的损伤.另外,为了保证实验过程的稳定性,需要待仪器的温度稳定后（约20-30 分钟）再开始实验.
3 活细胞成像实验后的图像分析在生殖医学基础实验中的重要性
为了在实验过程中获得可靠、稳定的数据,活细胞成像过程中最重要的一项就是为细胞提供一个最佳的生理环境.这就要求在细胞培养的过程中不仅要确保细胞的存活,还要将细胞保持在一个稳定的代谢状态.所以,实验过程中保持一定的温度（36.5℃&plun;0.5℃）、pH 值和培养基中的离子浓度等就显得尤其重要.但在实际上,因温度、空气干湿度、液面面积和容器敞开等因素,细胞培养液的自然蒸发是客观存在的.另一方面,由于气体交换的需要,完全地密封培养容器是不现实的.但液体的蒸发对渗透压的影响会随着时间的延续逐渐明显起来.所以在进行活细胞成像的时候,在不影响拍摄的情况下,需要尽量地增加细胞培养液的体积来尽可能减少液体的蒸发对细胞渗透压以及细胞代谢状态的影响.
活细胞成像后的图像分析同样是非常重要的.图像处理主要是将直观的图像转变成有意义的信息.对图像分析处理的过程,主要是降低图像的背景噪声,增强图像的对比度以及对信号强度进行定量分析.但需要注意的是,在优化图片质量和分辨率的同时,也要确保图片能够反映其原本蕴含的原始信息.
4 分析总结实验过程中遇到的问题在生殖医学基础实验中的重要性由于影响活细胞成像实验的因素很多,细胞培养过程中状态不好或者细胞转染效率低都会导致活细胞成像实验的失败,加上卵细胞本身对外界的各种刺激就比较敏感,所以及时总结实验过程中遇到的问题显得比较重要.比如导致细胞转染效率低的原因主要包括以下几个方面：质粒纯化的问题；不恰当的细胞密度；没有优化阳离子脂质体试剂和DNA 的量；DNA- 阳离子脂质体试剂复合物在存在血清条件下形成等.细胞转染后死亡率高的原因主要包括以下几个方面：细胞太少；在细胞转染过程中使用抗生素；DNA 量太高；阳离子脂质体试剂量太大等.
实验结束后,对自己的实验结果进行分析和总结,还可以避免下次可能出现的错误.这样不仅增加了对实验的理解和兴趣,还锻炼了独立思考和勇于创新的能力,对于以后的科研工作无疑起到了积极的推动作用.
总之,活细胞成像技术已经成为生殖医学研究中一项必不可少的技术.如能做好活细胞成像实验前准备、实验后图像处理以及认真分析总结实验过程中遇到的各种问题等活细胞成像各个环节的工作, 不仅掌握了活细胞成像技术的理论和实验内容,还培养了学生的独立思考和创新思维等科研必备的能力,为后续开展生殖医学相关科研工作奠定了坚实的基础.
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编辑李金枝
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