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【摘 要】目的：探讨冷冻切片制作流程中容易出现的问题和对策,总结经验,旨在提高冷冻切片质量.方法：回顾性分析我院2011 年11 月-2017 年12 月接收的术中冷冻样本1071 例,由两位经验丰富的病理医师阅片,为冷冻切片判读分两级,即优良片和差片.结果：统计本组冷冻切片优良率为98.7%.结论：冷冻切片质量受很多因素影响,病理技师只有通过不断地研究和总结,有利于病理医师迅速地作出正确的病理诊断.
【关键词】冷冻切片；问题；对策；提高质量
冷冻切片在病理工作中是一种重要的制片法,将新鲜组织经过急速低温冷冻、变硬后切成薄片再经染色等步骤,制成便于光镜观察的组织切片技术.它与常规石蜡制片相比,突出的优点是操作简便、迅速省时、易于光镜下观察,因此在外科手术中广泛应用[1].同时冷冻切片能良好地保存脂肪、类脂质及各种酶的活性.本文结合安岳县人民医院2011 年11 月-2017年12 月接收的术中送检冷冻样本1071 例,针对冷冻切片出现的问题进行分析,现总结如下.
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集安岳县人民医院自2011 年11月-2017 年12 月接收门诊或住院患者术中冷冻切片病理检查1071 例.本组男女比例151:920, 年龄9-87 岁, 平均(47&plun;5) 岁.所有患者均自愿选择术中快速冷冻切片病理检查,签署知情同意书,一式两份.
1.2 材料
（1）OCT 支持剂；
（2）洁净的玻片；
（3）1% 盐酸乙醇分化液；
（4）苏木精染液、醇溶性伊红液；
（5）梯度乙醇、透明剂、中性树胶.
1.3 仪器
德国徕卡CM1950恒温箱冷冻切片机,美的EG720KG4-NA 型号的微波炉.
1.4 方法
1.4.1 预先准备
病理技师提前1 小时将冷冻切片机箱体和冷冻头温度降至-22℃左右；预冷样本头；调试仪器,确认运转正常；预冷95%乙醇固定液；过滤苏木精染液并预热至37℃.
1.4.2 冷冻样本接收
病理科认真核对手术室送检的新鲜样本,核对无误后,详细记录患者的基本信息,冷冻组织名称和冷冻病理编号,样本件数,接收样本时间,送检人和验收人双签名.
1.4.3 取材
病理医师检查送检样本,选择2~3 块具有代表性的组织块,与病理技师交接.
1.4.4 包埋与切片
技师将组织块放置在样本头上,滴加少量OCT 支持剂,立即将其置于冷冻切片机内速冷区域,并放上冷冻锤.待组织与冷冻锤分离,即可开始切片.将冻好组织块的样本头在切片机夹头上夹紧,以对角线作为切入口,粗修至最大切面；分别选择切片厚度分别为6 微米和4 微米( 除脂肪组织选择15 微米的切片厚度外),快速细修2~3 次后,分别切出完整的切片两张,按照载玻片左侧6 微米、右侧4 微米的切片附贴原则,将两张厚度不同的切片附贴在同一张编好号的载玻片上.
1.4.5 固定与染色
将冷冻切片立即放入95% 冷乙醇中固定1min,水洗数s,按规范进行快速HE染色.
1.4.6 封固与交接
冷风干燥切片,中性树胶封固,粘贴标签.再次核对无误后与病理医师交接,记录交接时间.整个制片时间共计约15min.
1.5 判读结果
由两位经验丰富的病理医师阅片,为冷冻切片评估分两级,即优良片和差片.优良片评估标准为：切片完整,厚度4~6μm,厚薄均匀,无褶无刀痕,冰晶小或无冰晶.染色核浆分明,红蓝适度,透明洁净,封裱美观.单件样本冰冻切片制片总时间≤ 15 分钟.
差片评估标准为：切片不完整,过厚、有皱褶、刀痕、大颗粒冰晶.细胞变形、核浆模糊不清、红蓝对比差.组织模糊、封裱不美观.影响病理诊断.
2 结果
本组冷冻切片优良率为98.7%.
3 讨论
术中快速冷冻病理诊断是病理医师最具风险的急诊工作,而高质量的冷冻切片是病理诊断的重要基础,因此病理技师要提高冷冻切片的质量,除了严谨的工作态度外,还需要熟练掌握冷冻切片制作环节中的注意事项、问题和相应的处理对策[2].（1）样本自身因素.冷冻样本要求必须新鲜,严禁沾水或液体浸泡.但是偶尔会出现人为意外情况,病理技师要准确判断样本受损程度并纠正改善组织情况.①少量液体附于样本表面,只需用吸水纸或干纱布吸掉水分即可；②大量液体如血液或囊液浸泡,尽量选择样本浸泡少的位置选取组织块,吸掉水分后,按照规范制作冷冻切片[3]；③固定液浸泡的样本,则用蒸馏水或生理盐水清洗多次,吸干组织表面水分,放在样本头上,加OCT 支持剂,稍凝结后入液氮罐内5 分钟后,取出在冷冻切片机上切片.
（2）取材.病理技师要与取材医师积极沟通,取材时要特别注意：①取材台面和器械保持干燥,切忌用水冲洗样本；刀具锋利,避免人为造成组织挤压；要注意避开线结、钢钉、结石、骨或钙化等会导致切片破碎或刀痕的异物；同时要避免在有大量出血坏死的区域选材.②选取的冷冻组织块平整且大小厚薄适宜, 20mm×20mm×3mm,厚度不超过4mm,太厚会延长冷冻时间；若是囊壁样组织须切成长条状,卷曲成U 形并竖立包埋；若是过于碎小冷冻组织,如直径<2mm 者, 建议取消冷冻切片.若有包膜、微小病灶或特定切面等,病理医师必须与病理技师明确交接,详细说明；病理技师需及时沟通病理医师,充分理解医师意图,制成符合要求的冷冻切片.
（3）包埋.新鲜冷冻组织在包埋时正确应用速冷区、OCT 支持剂和冷冻锤非常重要.一般先在预冷的样本头滴加少许包埋剂,因低温使包埋剂稍凝结发白,快速将组织块放上轻压,使组织处于同一水平切面,再覆盖少许支持剂.然后将样本头置于冷冻切片机速冷区,并放上冷冻锤使组织平整,并加快冷冻速度.有研究证明：急速冷冻,可以防止或减少冰晶的出现.碎小组织包埋时,建议先用OCT 支持剂在样本头上做一个冷冻台,粗修成一个带平台的样本头备用.然后将碎小样本放置在平台上,覆盖OCT 支持剂.这种方法可以使所有的组织都在同一个水平面上,有利于完整切片.
（4）冷冻温度的选择、冷冻速度和冷冻时间,对于冷冻切片都非常关键.大量文献显示,不同组织适宜不同温度：例如富于脂肪的纤维脂肪组织、乳腺组织、皮肤组织及脂肪肿瘤为-40~-35℃,质地柔韧的组织为-18~-25℃ [1],质地偏脆软的组织为-18~-20℃,碎小组织则为-15~-18℃.而在基层病理科的实际工作中,一个病例取材可能有多个不同组织的样本,技师不可能为每一个样本更改冷冻温度,通常是设置为-22℃左右,因此难以制作出最佳的冷冻切片.
急速冷冻与缓慢冷冻的区别：有研究指出,急速低温冷冻组织时,细胞内液和细胞外液同时结冰,形成玻璃状态,镜下表现为细胞的形态保存良好,无收缩,无冰晶或细小冰晶,利于显微镜下观察病变.而缓慢降温导致细胞内液的水分子向细胞外游离聚集,然后凝结成冰晶,细胞发生膨胀和机械性挤压,导致细胞形态发生变化；染色过程升温时,冰融化留下空洞,显微镜下见大小不一的空洞,形状颇似核偏位的脂肪细胞或印戒样细胞,严重影响冷冻诊断的正确性.
（5）切片：一般来说,病理技师选择组织块的对角线作为切入口,同时注意“留根”,即切片时注意不要将组织全部切掉,让其稍有一点连结,然后用毛笔由上至下把组织拨平整,载玻片附贴.另外,本文作者一般制作2 套冷冻切片,1 套做染色,另1 套则在固定液中备用,当需要重新染色时,可以节约时间.
（6）脱片：快速HE 染色中,切片经历骤冷骤热和水洗作用,或载玻片有灰尘、霉菌等杂质,或切片太厚,可能出现掉片.因此制作冷冻切片时一定要用洁净的玻片,必要时可采用冷风干燥切片、防脱载玻片、或利用漂烘仪烤片等方法防止脱片.
（7）静电：有文献探讨冷冻切片附贴的静电现象,建议病理技师切片时减少毛笔刷扫切片台,或摘下橡胶手套后附贴切片,但是,由于新鲜样本可能带有可被传播的感染源,病理技师须遵循标准预防措施,做好个人防护,因此本文作者不支持此种做法.
（8）固定：我科采用95% 冷乙醇作为固定液.95% 乙醇具有低廉、穿透力强、无污染等优点；且对比甲醇、甲醛等试剂,无毒副作用,是非常合适的固定液.预先冷却乙醇,可以减少因温差掉片的可能性.
（9）染色与封固中出现的问题：因病理技师操作不当或时间不足,可能出现染色不佳、脱水不佳、封固不佳等问题.有相关文献详细探讨过这些问题的原因分析和应对措施,本文作者就不赘述了.
总之,冷冻切片质量受很多因素影响,有一定的局限性,病理技师只有通过不断地研究和总结,才能制作出高质量的冷冻切片,有利于病理医师迅速地作出正确的病理诊断,满足临床需求,节省患者就医时间.
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